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多孔淀粉―在乳酸菌微胶囊制剂上的开发与利用
[浏览次数:876 次] [更新时间:2017-11-6]

多孔淀粉―在乳酸菌微胶囊制剂上的开发

与利用

 

王学佩     刘侠   王金玲

河北沧州兴济华雨药业公司061022

 

以乳酸杆菌属(Lactobacillas)和双歧杆菌属(Bifidacleriam)为代表的乳酸菌生理作用明确,安全,是微生态活菌制剂的重要菌源。但因其兼性或专性厌氧、不形成芽孢,而抗逆能力差。本研究根据已有材料,确定适合于乳酸菌微胶囊化的多孔淀粉生产工艺和微胶囊生产工艺。α—淀粉酶和糖化酶比为8:1,最挞温度55℃,时间28h,Ph5.6

,多孔淀粉:成膜材料:菌液为27:3:70,喷雾干燥进风与出口温度为112℃、52℃

 

关键词:乳酸菌、多孔淀粉、复合酶解、微胶囊工艺

多孔淀粉又称微孔淀粉(Microprous starch)是指具有生淀粉酶活力的酶在低于淀粉糊化温度下作用于生淀粉颗粒后形成的一种蜂窝状多孔变性淀粉。其小孔直径为1μm左右,小孔布满整个淀粉颗粒表面,由表及里向中心深入,孔的容积占颗粒体积的50%左右。而以乳酸杆菌属和双歧杆菌属为目的菌的乳酸菌直径一般不大于1μm,进入多孔淀粉的孔中,淀粉孔成为一个纳器,以钻入乳酸菌的多孔淀粉为心材,外面再封孔和包膜成为结构特殊的微胶囊。这种微胶囊具有缓释、抗逆能力,但一般酶解得到的多孔淀粉因颗粒结构受到一定程度的破坏,结构疏松,其冻融稳定性、温度稳定性、抗剪切能力、颗粒坚固性、粘度稳定性等均低于原淀粉,而活菌微胶囊制剂所需心材重点解决孔径≥1μm,孔的容积大,整个微胶囊坚固,不易碎。而多孔淀粉孔的形成取决于淀粉及淀粉酶的来源,品种及酶解条件,控制淀粉水解程度,即调节孔数、孔径、孔深、颗粒坚固性及结构稳定性。根据活菌制剂所需,我们生玉米淀粉为原料,确定组合酶解条件对多孔淀粉形成的影响参数,包括酶底比,缓冲液的pH值,酶解时间、温度等,确定最佳工艺条件,通过化学交联经增强其结构稳定性,选择交联剂和工艺条件,在形成微胶囊的过程中选择喷雾干燥方法。对乳酸菌以多孔淀粉为心材微胶囊工艺进行探讨。

普通玉米淀粉属于谷类淀粉,淀粉颗粒大小中等,直径5~26um,形状为圆形和多角形,1kg玉米淀粉含1.3 X 1012颗粒,由于直链淀粉含量相对较高达28%,含脂类化合物多,易形成直链粉-脂类化合物,颗粒紧密。

生淀粉酶属于淀粉酶的特殊种类,但至今还没有一个严格定义。一般来说生淀粉酶是指可以直接作用未经蒸煮的淀粉颗粒的酶,生淀粉酶所涉及的酶有好几种,如α—淀粉酶能激活、加速糖化酶和活力。Tommoshisa TAKAYA等认为,粗酶的活性大于结晶酶(纯酶)的活性,内含α—淀粉酶的糖化酶的活性大于不含α—淀粉酶的纯糖化酶,具有生淀粉酶活力的各种酶之间有协同作用,单一纯酶的水解活力并不理想,需要有协同效应的酶共同作用,才能达到较高的水解能力。

因此,综合参考资料,能形成多孔淀粉,并有应用潜力的生淀粉酶主要是糖化酶、α—淀粉酶。

从生产效能上看,选择两咱以上复合酶协同使用是我们选择酶系的目标。

生淀粉α—淀粉酶(1,4-α-D-葡聚糖水解酶,α-amylase,EC.3.2.1.1)是内切型淀粉酶,它作用于淀粉时从淀粉分子的内部任意切开α-1,4键,使淀粉分子迅速降解,失去粘性和碘的呈色反应,同时使水解的还原力增加。

生淀粉糖化酶(生淀粉葡萄淀粉酶,1,4-α- D-葡聚糖水解酶, α-1,4-Glucan glucohydrolase,EC.3.2.1.3)是外切型淀粉酶,由2种同功酶组成,葡萄粮淀粉酶I分子时66,000 Da,而酶II与酶I有相同的氨基酸顺序,只是在羧基末端少一段,该酶能从淀粉或糖无的非还原末端开始,以葡萄糖为单位进行水解,虽然葡萄糖淀粉酶能优先水解α-1,4-葡糖苷键,但对α-1,3-葡糖苷键和α-1,6-葡糖苷键也有一定活性,只是水解速度很慢,仅及水解α-1,4-葡糖苷键活性的6.6%和    3.6%。

 

1、        材料与方法

1.1实验材料

生玉米淀粉、黑曲霉糖化酶、芽孢杆菌α-淀粉酶、金龙鱼大豆色拉油、柠檬酸(分析纯)、磷酸氢二钠(分析纯)、氢氧化钠(分析纯)、甲苯(分析纯)、乙醇(色谱纯)、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌、培养乳酸菌用MRS培养基(酪蛋白胨:10g、牛肉高:10g、酵母高:5g、无水乙酸钠:5 g、柠檬酸三胺:3 g、磷酸氢二钾:2 g、硫酸镁:0.56 g、硫酸锰:0.28 g、葡萄糖:20 g、吐温-80:1 g、琼脂:15 g、蒸馏水1000mL,pH6.2-6.4)、其它为常规试剂分析纯

1.2、实验设备

超净工作台、磁力搅拌器、阿贝折光仪、FA1004上皿电子天平、SHB III循环水式多用真空泵、旋转蒸发器、乳酸菌发酵与检测设备(分析天平,感量为0.0001、平皿:直径为9cm、试管:18×180mm、吸管:容量为1mL、三角烧瓶:容量为250mL、玻璃珠:直径为5mm、洒精灯、试管架、橡皮胶头及其它)、W501升降恒温水浴锅、振荡器、DRZ-4型电阻炉温度控制器、722光栅分光光度计、PHG-91013SA型电热恒温鼓风干燥箱、LXJ-II离心沉淀机。LP-500型离心式喷雾干燥塔、其它

1.2实验方法

1.2.1生淀粉酶活力测定

2.5%(w/v)生玉米淀粉悬液2.0mL加入到50mL三角瓶,加pH3.5的0.2%mol/L Na2HPO4-0.1mol/L柠檬酸缓冲液2.0mL,40℃预热10min,加入1.0mL适当稀释的酶液,在40℃恒温下振荡反应30min后,加4%的NaOH溶液0.5mL终止反应。反应液用3000r/min离心20min,上层清液用DNS法测还原糖。

酶活定义:在以上分析条件下,1h释放1mg葡萄糖的酶量为一个洛力单位。

1.2.2多孔淀粉产物得率测定

    称取表面培养皿重量(精确至0.001g),加入水解得到的湿多孔淀粉,在60℃下常压干燥,称取总重量,两者的重量差即为反应后多孔淀粉的重量,再除以反应前淀粉的重量,即可得到多孔淀粉产物得率。

1.2.3多孔淀粉吸油率测定

   称取多孔淀粉B克(精确0.0001g),恒温下与5mL大豆色拉油混合搅拌30min,置于已知重量C克(精确0.001g)的砂芯漏斗抽滤,直至没有液滴滴下。根据砂芯坩埚重量D克(精确0.0001g),计算吸油率A%。

                               D-B-C

                         A%=             × 100%   

                                 B

1.2.4酶作用的协同效应

分别经糖化酶、α-淀粉酶和复合酶作用淀粉颗粒,每隔4h取样,测定各自在不同反应时间的吸油率,比较淀粉颗粒在不同酶作用下的成孔情况,验证双酶复合作用。

1.2.5多孔淀粉酶解工艺

20g生淀粉加入到250mL三角瓶中,加pH4.6的0.2mol/L Na2HPO4-0.1mol/L 柠檬酸缓冲液40mL,滴入1滴甲苯,加入适当稀释的酶液,在40℃恒温下振荡反应24h后,离心(3000r/min,20min),分离上清液,沉淀在60℃下常压干燥,粉碎即可。

1.2.6 固形物

用阿贝折光仪在20℃下恒温测定。

1.2.7 DE值(还原糖测定)

称取样品2.0000g加入水溶解,以斐林法测定还原糖的量

                               

 250×Rp

                         DE=             X 1000

                             M ×V ×DMC

Rp--------- 1mL斐林溶液相当于葡萄糖的质量(mg);

M --------- 样品质量(g);

V --------- 滴定消耗样液的体积(mL);

DMC-------- 试样中固形物的百分含量。

1.2.8乳酸菌活菌数的测定

1.2.8.1采样

采样时必须特别注意样品的代表性和避免采样的污染。首先准备好灭菌容器和采样工具。采样后应尽快检验,否则将样品放在低温干燥处。   

1.2.8.2试样稀释及培养

1)精确称取产品1g(精确至0.0002g),转入内装99mL无菌生量盐水和几颗玻璃珠的三角瓶中,摇动三角瓶(200r/min,30-40min),使样品充分溶解备用,经充分振荡制成1:100的均匀稀释液。

2)吸取上述的待检液1mL,加入装有9mL无菌生理盐水的试管中,(注意吸管尖端不要触及管内稀释液)振荡摇匀,作成  1:1000稀释液。

3)按2操作,至样品溶液稀释到1×10-8备用。每一次操作必须用无菌吸管,吸管不可重复使用。

4)选择2-3个适宜稀释度,吸取1mL稀释液于平皿内,每个稀释度做两个平皿。

5)稀释液移入平皿后,应及时将凉至46±1℃的MRS培养基注入平皿15mL,小心转动平皿使试样与培养基充分混匀,从稀释试样到倾注培养基之间,时间不能超过15min.

6)待琼脂凝固后倒置平皿于30±1℃恒温培养箱内培养,72±3小时后取出,计数平板内菌落数目,菌落数乘以稀释液倍数,即得每克样品中所含乳酸菌的活菌总数。

1.2.8.3、菌落计数方法:做平板菌落计数时,可用肉眼观察,必要时借助放大镜检查,以防遗漏。在计数出各平板菌数后,求出同一稀释度两个平板的平均数。

1.2.8.4、菌落计数的报告

以3个重复的菌落数相差不悬殊,每个平皿菌落数在30-300之间来确定此操作的准确性,否则需要重新操作。最终菌落数总数取3个平皿中的菌落总数的平均数。以上操作均为无菌操作。

1.2.8.5、稀释度的选择

1)应选择平均菌落数在30-300之间的稀释度,乘以稀释倍数报告之。

2)如有两个稀释度,其生长的菌落数在30-300之间,视两者之比如何来确定,如其比值小于2 ,应报告其平均数;如大于2,则报告其中较小的数字。

3)如所有稀释度平均菌落数均大于300,则应按照稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。

4)如所有稀释平均菌落数均小于30,则应按照稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。

5)如所有稀释度均无菌落生长,则以小于1乘以最低稀释倍数报告之。

6)如所有稀释度平均菌落数均不在30-300之间其中一部分大于300或小于30时,则以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。

1.2.8.6、结果报告

菌落数在100以内时,按其实有数报告,大于100时,采用两位有效数字,在两位有效数字后面的数值,以四舍五入方法计算。为了缩短数字后面的零数,也可用10的指数来表示。

关于实验方法中的测定方法与指标的确定,主要从实际出发,如多孔淀粉吸油率作孔穴体积对比的一个指标,是因为油质均质,受条件影响小,实际生产中乘以乳酸菌与油脂比值就可以得吸乳酸菌液的能力了。原料玉米淀粉的吸油率测定值为68.4% 。

乳酸菌

按照农业部规定的菌种目录,根据多孔淀粉孔径大小,抗热能力,我们选择嗜酸乳杆菌和两栖双歧杆菌为目的菌株。

1.2.8.7计算

X = A×10B

式中:X--------每克样品中活菌数(个/克);

      A--------最终计数的菌落总数;

      B--------稀释倍数。

 

2、实验结果

2.1双酶的复合作用

  分别以糖化酶、α-淀粉酶和复合酶作用淀粉颗粒,每隔4小时取样,测定各自在不同反应时间的吸油率,结果如图所示:

               

由图不难看出,由于α-淀粉酶是内切型淀粉酶,从分子内部进行水解中间地位的α-1,4键,其对直链淀粉的水解分为两个阶段,先是快速的把直链淀粉水解成麦芽糖和麦芽三糖,然后进入第二步,把麦芽三糖水解成葡萄糖和麦芽三糖,速度缓慢,而其对支链淀粉的水解速度较直链淀粉慢。从图上也看出反应8h后吸油率达到顶峰,以后缓慢进行,生淀粉 糖化酶是外切型淀粉酶,是从非还原末端的α-1,4键开始,也是作用于长链,比短链活性大。水解速度慢而平和。在作用于淀粉颗粒表面时,在镗孔的同是表面粗糙部分被作用,吸油率是表面粗糙部分的损失与镗孔作用的综合反映,而当两者协同作用时,成孔效率明显提高,在24h后淀粉吸油率超过110%估计是α-淀粉酶的随机作用产生了大量的糖化酶可以作用的位点,然后糖化酶在成孔方发挥了作用,证明双酶作用的复合效应。

2.2酶解单因素实验

为了确定工艺参数所需,对双酶配比、加酶量、反应时间、反应体系pH、反应体系温度进行了单因素实验。双酶为曲霉菌产生的生淀粉糖化酶(标示量2000IU/mL)和芽孢杆菌产生的α-淀粉酶(标示量1500IU/mL)。

2.2.1酶配比实验

糖化酶:α-淀粉酶为:6:1 ;8:1;10:1;12:1;14:1,结果如图所示:

A, 6:1; B, 8:1;   C,10:1;  D, 12:1;  E,14:1

图示说明双酶此为8:1时,多孔淀粉孔穴体积最大。

2.2.2加酶量实验

加酶量即理论酶解淀粉的百分含量(30%;35%;40%;45%;50%;55%),结果如图所示:

加酶量为理论水解50%的淀粉的量加入时,吸油率出现最高值,加入过多的酶反而破坏孔洞的形成,致使吸收油率下降。最好值为50%。

2.2.3反应时间实验

采取每隔4小时取一次样,随着时间的增加,吸油率呈上升趋势,在28小时达到顶峰,而后陌时间延长逐渐下降。可能是已形成的孔洞结构受到破坏。

2.2.4温度实验

对酶反应的温度(30℃;35℃;40℃;45℃;50℃;55℃;60℃;65℃),结果如图:

温 度 实 验

低温时酶反应速度缓慢,随温度升高而反应加剧,55℃吸油率最高,由于酶的热变使酶失活,在65℃时酶大部分失活,最佳反应温度为55℃,由于双酶的最高耐受温度不一样,耐高温α-淀粉酶在60℃反应增强,但糖化酶逐渐失活,总体上看60℃时酶解不充分,多也淀粉吸油率下降。

2.2.5反应体系中pH值的实验

对其中酶反应的pH(3.6;4.6;5.6;6.6;7.6;8.6),结果如图:

由图可知,组合酶在酶反应体系中pH为5.6附近得到多也淀粉的吸油率最高。

   通过以上试验,初步确定了以生玉米淀粉为原料,以α-淀粉酶和糖化酶双酶协同反应,生产多孔淀粉工艺条件为:反应温度55℃,反应时间28h,pH5.6,双酶比为8:1,加酶按理论水解50%淀粉量加入。

2.3放大实验

以所获参数为条件,在5L酶解罐中,加入2Kg玉米淀粉,分别在反应到26,27,28,29,30h取样检测吸收率,结果如图:

经放大实验获得数据看,在29h左右达到最佳,说明反应时间对多孔淀粉有影响。以此为数据,在500L酶解罐中,加入200Kg玉米淀粉,制取产品,最终经喷雾干燥后,测得吸油率达148%。

这些多孔淀粉为下步乳酸菌包被做材料。

   2.4交联多孔淀粉的制备

取100g多也淀粉在250mL蒸馏水中调浆,40℃预热10min后,用1mol/l的NaOH调pH10,在45min内用微量进样器缓慢加入POCl3 100μl,,并用NaOH维持pH值的恒定,反应120min后,用1.0mol/ml HCL中和至pH5.5,淀粉乳离心洗涤三次,烘箱内40℃干燥,得交联多孔淀粉。交联淀粉的吸附与坚固情况如图:

交联后吸油率没有增多少,但坚固情况增加,随着时间的延长,孔穴塌陷,造成吸油率降低。

2.5微胶囊试验

2.5.1直接吸附试验

将制备的嗜酸乳杆菌发酵汐,5×109CFU/ml,双歧杆菌发酵液5×108CFU/ml,各100mL,各取50g多孔淀粉为心材,边加入发酵液边缓慢搅拌,然后冷却干燥。干燥7天后测定包被活菌量为:嗜酸乳杆菌为2×109CFU/g,双歧杆菌为3×107CFU/g。

2.5.2喷雾干燥试验

按嗜酸乳杆菌、双歧杆菌生产工艺,用500升发酵罐,各正常生产1罐,获得嗜酸乳杆菌液450升,双歧杆菌液450升,血球计数板初步测得嗜酸乳杆菌活菌量为6×109CFU/ml,双歧杆菌活菌量为5×108CFU/ml,将发酵液按嗜酸乳杆菌组、双歧杆菌组、嗜酸乳杆菌+双歧杆菌组分为三组,每组300升,分别加入100公斤多孔淀粉和3%的成膜物质(壳聚糖、阿拉伯胶及玉米蛋白粉)。经离心式喷雾塔干燥,进风温度112℃,出风温度52℃。喷干后微胶囊水份含量为6%,数据如下:

 

组别

进风口温

度(℃)

出风口温度

发酵液活菌量(CFU/ml)

产品活菌量(CFU/g)

活菌保持量(%)

嗜酸乳杆菌组

112

52

6×109

2.5×109

42

双歧杆菌组

112

52

5×108

8×106

1.6

嗜酸+双歧组

112

52

3.25×109

1.2×109

38

注:嗜酸+双歧组中,双歧杆菌存活率只有2%左右。

 

3、电镜扫描(SEM)照片分析

通过电子显微镜(SEM)可以直观的看到多孔淀粉的成孔与包被情况。

(图1)为原生玉米淀粉,可以看到生玉米淀粉颗粒较均匀,质密;

    

(大颗粒)                 (小颗粒)

图 1                 

图2不同加酶量形成的多孔淀粉图片。  从图中可以看出随着加酶量增加,孔径变粗加深,最酶量多而造成陷塌破解。

 

   

30%             50%                 55%

2

图3为复合酶水解时间不同后的SEM照片, 从图中可以看出水解时间影响孔径大小多少,时间过长反而造成多孔淀粉破碎,不完整

     

(12h)               (28h)               (32h)

图3

图4为交联多孔淀粉孔径变化不大。

          

图4

图5为直接乳酸菌吸附后的多孔淀粉SEM图片,可以清楚的看出孔径中的菌团。多孔淀粉颗粒成乳酸菌的纳器和壁材。

         

图5

图6为加入了成膜性物质后多孔淀粉变成微胶囊内部情况的SEM图。从这些图中可以看出乳酸菌藏入多孔淀粉的孔中,外边一层膜包被,孔被塞上,这种情况下,多孔淀粉即是乳酸菌的纳器,也是心材,被外面成膜材料包被。

   

(A)                (B)                 (C)

图6

     (A)为微胶囊乳酸菌;(B)为5-20um微胶囊,外边被成膜材料包被;(C)为切开的微胶囊可清晰看菌团和孔穴情况,及外边的成膜情况,膜厚度在0.5-1um左右。

 

4、讨论与小结

4.1以生玉米淀粉为原料以复合酶水解方式生产多孔淀粉作乳酸菌的微胶囊心材可行。生产工艺参数为:

α—淀粉酶和糖化酶双酶比为8:1,温度55℃,反应时间28h,Ph5.6,喷雾干燥进风口112 ℃ 出风口52℃。

不同植物的生淀粉的结构不同,价格也不同,选择颗粒均匀、质密、便宜的淀粉为原料,以此出发选择单酶、双酶或更多酶组合要根据原料进行探索。

4.2多孔淀粉的交联处理是为增加吸附能力、疏水或亲水能力还是坚固性,这要看需求所需而定。本试验中证明交联后可以增强坚固性,其它方面有待探讨。

4.3以多孔淀粉为心材,进行嗜酸乳杆菌和双歧杆菌微胶囊化处理,其结果可看出,嗜酸乳杆菌活菌存活率达到3 %,双歧杆菌较低,双菌混合后,双歧杆菌存活率稍有提高。

4.4从电镜SEM图片分析,包被后乳酸菌被藏在多孔淀粉的孔穴中,外边的孔被封住,大部分多孔淀粉颗粒被包上一层膜。从而双重保护了孔穴中的乳酸菌。这种喷雾干燥法生产的微胶囊化乳酸菌粉抗逆能力、货架时间明显好于直接吸附形成的微胶囊乳酸菌产品。如何选择更好的膜性材料来保护乳酸菌有待进一步探讨。

 

参考文献81篇(略)

 

联系单位:河北沧州兴济华雨药业有限公司

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