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益生菌对黄曲霉毒素吸附作用的研究
[浏览次数:1016 次] [更新时间:2017-11-3]

益生菌对黄曲霉毒素吸附作用的研究

 

刘畅,刘阳[1]*,邢福国,魏益民

(中国农业科学院农产品加工研究所/农业部农产品加工与质量控制重点开放实验室,

北京 100193)

 

摘要:为了获取能够高效吸附黄曲霉毒素B1(AFB1)的益生菌,研究了16株益生菌对培养基中AFB1的吸附效果。发现11株菌对AFB1具有明显的吸附效果,其中吸附效果最佳的是酿酒酵母Y1,其菌体处理方式和吸附时间经过优化后,对AFB1的吸附率可以达到81.16%。复合物稳定性实验结果表明,Y1与AFB1是通过物理方式结合在一起的,且这种结合是可逆的。此外,经加热处理后,各菌株对AFB1的吸附能力均显著增强,扫描及透射电镜观察发现,加热处理后Y1菌体表面由光滑变得凹凸不平,并且其细胞壁厚度由90.70nm变为225.58nm,增加了148.73%,这些结果表明,加热处理后Y1与AFB1的接触面积明显增大,从而导致Y1对AFB1的吸附能力明显增强。

 

关键词:黄曲霉毒素的吸附;益生菌;吸附机理

Binding of Aflatoxin B1 by Probiotics

LIU Chang, LIU Yang*, XING Fu-guo, WEI Yi-min

(Institute of Agro-food Science and Technology, Chinese Academy of Agricultural Sciences/ Key Laboratory of Agricultural Product Processing and Quality Control, Ministry of Agriculture, Beijing 100193, China)

Abstract: In order to obtain probiotics which could efficiently bind aflatoxin B1 (AFB1), AFB1 binding abilities of 16 probiotics strains in culture medium were tested. Results showed that 11 strains had the ability to bind AFB1. Y1 was the best strain in binding AFB1, it could bind 81.16% AFB1 after cell treatment and binding time being optimized. Complex stability experiment proved that mycelium and AFB1 were combined by physical binding, and the combination was reversible. In addition, binding abilities of all strains were enhanced after being heated. Scanning and transmission electron microscope observed that Y1 cells’ surface which was smooth became wrinkling, and the cell wall thickness was increased from 90.70nm to 225.58nm, which was thicker 148.7% after being heated. The above changes both could increase contact area of Y1 and AFB1, therefore, binding ability of Y1 was greatly enhanced.

Key wordsbinding of aflatoxin; probiotics; binding mechanism

 

前言

黄曲霉毒素(Aflatoxin, AFT)是一类能够致癌、致畸、致突变的真菌毒素,被世界卫生组织列为一级致癌物。这类毒素主要包括AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2、AFB2a、AFG2a、AFBM2a、AFGM2a等,其中AFB1毒性最强。黄曲霉毒素主要存在于玉米、花生等食物中,它的污染是一个全球性的问题,在发展中国家尤为严重[1]。因此,迫切需要一种高效安全的脱毒方法来消除这类毒素对人类健康的危害。传统的物理、化学脱毒方法在实际应用中可能对食品或饲料的色、香、味有不同程度的破坏、导致食品或饲料营养价值的降低,而微生物脱毒方法处理条件温和,不会破坏产品的品质,因此成为近年来研究的热点。微生物学脱毒主要包括两个方面:降解作用和吸附作用。目前,国内外已经筛选出了一些能够降解AFB1的微生物,如诺卡氏菌DSM 12676[2]、嗜麦窄食单胞菌[3]、假密环菌[4]等,但是目前还没有研究表明这些AFB1降解产物是否安全。另一方面,利用益生菌吸附AFB1,形成菌体-毒素复合物,然后将菌体-毒素复合物与食品分离,能够达到去除食品中AFB1的目的,该方法简便、经济、不会产生二次污染,具有较好的开发应用前景。El-Nezami 等[5]筛选出了对AFB1具有较强吸附能力的鼠李糖乳杆菌GG和LC-705,李志刚等[6]也筛选出了能吸附生理盐水中AFB1的乳酸菌。目前,国内外筛选出的能吸附AFB1的菌株多是乳酸菌,而对酵母的筛选研究则较少。本实验旨在筛选出新的能够高效吸附AFB1的益生菌,特别是酵母,并研究其吸附机理,为实际应用提供技术支持。

 

1材料和方法

1.1材料

1.1.1主要试剂  AFB1标准品  美国Sigma公司;乙腈(分析纯)  国药集团化学试剂有限公司;三氟乙酸(分析纯)  上海诺泰化工有限公司;乙腈(色谱纯),甲醇(色谱纯)美国Fisher公司;纯净水  杭州娃哈哈食品有限公司。

1.1.2 主要仪器  SKY-1102c型全温度恒温摇床  上海苏坤实业有限公司;YJ-1450型超净工作台  江苏苏州净化设备公司;3K15型离心机  德国Sigma公司;D10-12型氮吹仪  杭州奥盛仪器有限公司;Genius 3涡旋混合器  德国IKA公司;Waters 2695型高效液相色谱仪  美国Waters公司;Waters 2475型荧光检测器 美国 Waters公司;Hitachi SEM-2500型扫描电子显微镜  日本Hitachi公司;Leica DM 750型光学显微镜  德国Leica公司。

1.1.3菌株  8株酿酒酵母(编号为Y1-Y8)分离自传统自制发酵食品、3株乳酸菌(编号为L1-L3)分离自乳制品,1株纳豆芽孢杆菌(编号为Bn)分离自日本纳豆,嗜热链球菌CICC6044(编号为L4)、乳酸乳球菌CICC6016(编号为L5)及酿酒酵母CICC1006(编号为Sc)均购自中国工业微生物菌种保藏中心,干酪乳杆菌干酪亚种CGMCC1.539(编号为L6)购自中国普通微生物菌种保藏中心。

1.1.4培养基  酿酒酵母培养基(YPD):酵母浸粉1%,蛋白胨2%,葡萄糖2%,自然pH;

乳酸菌培养基(MRS):蛋白胨1%,牛肉浸膏1%,酵母提取物0.5%,葡萄糖2%,吐温80 0.1%,柠檬酸氢二铵0.2%,MnSO4·H2O 0.025%,MgSO4·7H2O 0.058%,K2HPO4·3H2O 0.2%,调节pH 6.8-7.0。

普通细菌培养基(NA):牛肉膏0.5%,蛋白胨1%,氯化钠5%,调节pH 7.0。

1.2 方法

1.2.1 益生菌培养  用接种环挑取一个单菌落接种于200ml相应培养基(装于500ml三角瓶)中,酿酒酵母置于30℃,200 r/min振荡培养36h;细菌置于37℃,200r/min振荡培养24h。菌液的浓度采用血球计数板进行计数。

1.2.2 菌体处理  根据计数结果取适量菌液,确保每份样品中细胞个数为:酿酒酵母4.0×109或细菌2.0×1010。将菌液分成活菌和死菌两组,活菌组10000r/min 离心5min弃去上清液,菌体直接用pH6.0的PBS冲洗两次,高速离心后收集菌体,最后将活菌体置于鼓风干燥箱中,37℃干燥1h;死菌组10000r/min离心5min弃去上清液后,先将菌体悬浮在pH6.0的PBS中100℃加热30min灭活菌体,然后用pH6.0的PBS冲洗两次,高速离心后收集菌体,最后将死菌体置于鼓风干燥箱中,80℃干燥5 min。

1.2.3益生菌菌体对黄曲霉毒素B1的吸附  向装有上述干燥菌体的离心管中加入1.95ml 相应培养基和0.05ml 1000ng/ml AFB1标准溶液,在30℃(酿酒酵母)或37℃(细菌)、200r/min振荡孵育2h。然后将菌悬液10000r/min离心5min,收集上清液。对照组是向相同容积的空白离心管中加1.95ml相应培养基和0.05 ml 1000 ng/ml AFB1标准溶液,并进行同样的处理。

1.2.4黄曲霉毒素B1含量的测定[7]  移取1ml上清液于100ml三角瓶中,再向其中依次加入1ml正己烷、5ml 乙腈 + 水(84 + 16)(分析纯),高速震荡10min,然后静止30min。最后取下层溶液2ml于尖底刻度试管中,60℃下氮气吹干。向尖底刻度试管中加200µl正己烷(色谱纯)和50μl 三氟乙酸衍生,剧烈振荡30s,静置5min,再加入1.95 ml 纯净水 + 乙腈(9 + 1),剧烈震荡30s,静置分层10min,取下层水相于2ml离心管中,10000r/min离心5min以去除杂质,最后取上清液于进样瓶中进行高效液相色谱测定。

高效液相色谱仪与一个2475型荧光检测器及一个C18柱相连,所有仪器受控于Waters操作系统。分析过程的流速为0.6ml/min,进样量为25μl,流动相为纯净水:乙腈 + 甲醇(70 + 17 + 17)及100%甲醇。

按如下公式计算益生菌菌体对AFB1的吸附率:y = ×100%

x1:AFB1初始浓度;x2:吸附后AFB1浓度;y:吸附率。

1.2.5菌体处理方式对Y1吸附AFB1的影响  在AFB1浓度25ng/ml、菌体添加量2.5×109cells/ml、吸附时间1h、吸附温度25℃、摇床转速200rpm的条件下,研究不同菌体处理方式(100℃加热30min、121℃高压灭菌30min、将菌体悬浮在0.1M CH3COOH溶液中震荡处理1h以及将菌体悬浮在0.1M NaHCO3溶液中震荡处理1h)对Y1吸附AFB1的影响。

1.2.6吸附时间对Y1吸附AFB1的影响  在AFB1浓度25ng/ml、菌体添加量2.5×109cells/ml、吸附温度25℃、摇床转速200rpm、菌体处理方式为121℃高压灭菌30min的条件下,研究不同吸附时间(5、10、30、60、90、120、240、480、720min)对Y1吸附AFB1的影响。

1.2.7菌体-黄曲霉毒素B1复合物稳定性的研究  菌体与AFB1吸附后,先用3ml蒸馏水冲洗离心管壁,以除去管壁上残留的AFB1,10000r/min离心10min去除上清液,再向离心管中加2ml溶剂,剧烈震荡10min,溶出复合物中的AFB1,10000r/min离心10min收集溶液,依照1.2.4的方法测定溶液中AFB1的含量。

1.2.8 扫描及透射电镜观察加热前后Y1细胞的变化  取适量100℃加热前后的Y1菌体,扫描样品经2.5%戊二醛固定,乙醇逐级脱水及临界点干燥处理,透射样品经2.5%戊二醛固定,包埋,切片及醋酸铀染色处理后,分别在扫描及透射电子显微镜下观察Y1细胞加热前后的变化。

1.2.9 数据处理

所有处理设3次重复,以3次重复的平均值用SAS 9.0作统计分析。

 

2 结果与分析

2.1 吸附黄曲霉毒素B1益生菌菌株的筛选

在试验的16株益生菌中,有11株菌对培养基中的AFB1有明显的吸附作用(见表1),并且经100℃加热30min处理后,这11株菌的吸附能力均显著增强(P<0.05)。其中,编号为Y1和Y2的酿酒酵母,无论是活菌体还是热灭活的菌体,对培养基中AFB1的吸附能力均显著高于其他菌株(P<0.05)。在活菌状态下,Y1和Y2对培养基中AFB1的吸附率分别为32.11%和29.26%,Y1的吸附能力显著高于Y2(P<0.05),经100℃加热30min灭活后,两株酵母菌的吸附率明显升高,分别达到49.53%和47.02%,但二者之间无显著差异(P>0.05)。另外,有3株酿酒酵母无论是活菌体还是热灭活的菌体对AFB1均有较强的吸附能力,吸附率为20-30%,其余菌株对AFB1的吸附率介于3%-20%之间。

表1 不同益生菌对黄曲霉毒素B1的吸附率

Table 1 Aflatoxin B1 binding by different probiotics(n = 3, X ± SD.SSR)

菌株编号

Strain number

黄曲霉毒素B1吸附率(%) Aflatoxin B1 binding (% of total)

活菌 Viable

热灭活菌 Heat-killed

Y1

32.11 ± 0.29a

49.53 ± 0.74a

Y2

29.26 ± 0.63b

47.02 ± 0.29a

Y3

11.52 ± 0.94f

21.49 ± 1.02e

Y4

6.31 ± 0.64h

12.92 ± 1.73g

Y5

3.17 ± 0.72i

8.57 ± 1.46h

Y6

27.21 ± 1.04c

25.62 ± 0.54cd

Y7

25.16 ± 3.37cd

30.89 ± 2.08b

Y8

23.56 ± 1.42d

26.40 ± 1.70c

Sc

0.00 ± 0.00j

25.12 ± 3.54cd

Bn

17.84 ± 1.51e

23.08 ± 1.71de

Lp

8.90 ± 0.89g

16.62 ± 1.81f

每行中数字后字母不同表示差异显著(P<0.05)。

Means in a line followed by different letters are significantly different (P<0.05).

2.2 Y1与AFB1的作用机理

2.2.1 菌体处理方式对吸附率的影响

图1 菌体处理方式对Y1吸附AFB1的影响

Fig.1 Effect of cell treatment on Y1 binding AFB1

从图1可以看出,加热处理能够明显提高Y1对AFB1的吸附率,与活菌相比,经100℃加热30min和121℃高温高压灭菌30min后,吸附率由65.13%分别提高到80.69%和81.59%,分别提高了15.56%和16.46%,而用0.1M CH3COOH溶液和0.1M NaHCO3溶液处理Y1并不能显著提高Y1对AFB1的吸附率。

2.2.2吸附时间对吸附率的影响

图2 吸附时间Y1吸附AFB1的影响

Fig.2 Effect of cell treatment on Y1 binding AFB1

由图4可知,Y1对AFB1的吸附是一个快速过程,在最初的5min,Y1即能吸附78.59%的AFB1,之后随着吸附时间的延长,吸附率逐渐升高,60min达到吸附饱和点(吸附率为81.16%),在饱和点之后,吸附率显著降低。

2.2.3 Y1-AFB1复合物的稳定性

表2 不同试剂对Y1-AFB1复合物中AFB1的溶出率

Table 2 Percentage of AFB1 bound to Y1 released on extraction by different solutions

溶液

Solution

溶出率(%)

% Bound AFB1 released

乙腈(acetonitrile)

56.56 ± 0.58a

甲醇(methanol)

52.06 ± 2.36b

苯(benzene)

16.63 ± 2.36c

氢氧化钠(sodium hydroxide)

18.28 ± 1.41c

盐酸(hydrochloride)

2.95 ± 0.50e

蒸馏水(distilled water)

6.21 ± 0.34d

 

 

 

 

    每行中数字后字母不同表示差异显著(P<0.05)。

Means in a line followed by different letters are significantly different (P<0.05).

从表2可以看出,甲醇、乙腈等试剂都能溶出Y1- AFB1复合物中的AFB1,其中甲醇和乙腈对复合物中AFB1的溶出率显著高于其他试剂(P<0.05),溶出率分别为56.56%和52.06%,0.1M 盐酸的溶出率最低,只有2.95%。这表明Y1与AFB1是通过物理方式结合在一起的,AFB1没有被降解。另外,甲醇和乙腈这两种对AFB1溶解能力很强的有机溶剂,对AFB1的溶出率也未达到60%,表明Y1与AFB1之间的结合能力比较强。

2.2.4 扫描及透射电镜观察加热前后Y1细胞的变化

扫描电子显微镜观察结果显示,经100℃加热30min处理后,Y1表面由光滑变得凹凸不平(见图1)。透射电子显微镜观察结果显示,加热后,Y1的细胞壁明显增厚(见图2):加热前Y1的细胞壁厚度为90.70 ± 0.18nm,加热后变为225.58 ± 1.06nm,加热后细胞壁厚度比加热前增加了148.73%。这些结果表明,加热处理后Y1细胞与AFB1的接触面积明显增大,从而导致Y1对AFB1的吸附能力明显增强。

图3 Y1细胞扫描电镜结果(A: 加热前;B: 加热后)

Fig.3 Results of Y1 cells’ scanning electron microscopy (A: before being heated; B: after being heated)

图4 Y1细胞透射电镜结果(A: 加热前;B: 加热后)

Fig.4 Results of Y1 cells’ transmission electron microscopy (A: before being heated; B: after being heated)

 

3 讨论

3.1 益生菌对AFB1的吸附作用

目前,国内外已经筛选出了一些能够吸附AFB1的菌株。El-Nezami等[5]筛选出的鼠李糖乳杆菌GG和LC-705,24h能吸附培养基中80%的AFB1。 Shetty[8]等人筛选出的酿酒酵母A18和26.1.11对PBS中AFB1的吸附能力分别为38.7% 和 36.1%,并发现指数期的酵母吸附能 力最强,且AFB1的初始浓度越高,酵母对其的吸附量也越多。国内方面,李志刚等[6]筛选出的8 株乳酸菌能够去除生理盐水中4%-49%的AFB1,其中干酪乳杆菌干酪亚种吸附AFB1的能力最强,吸附率为49%。

本研究在国内首次筛选出了8株能够吸附AFB1的酿酒酵母,但是这些酿酒酵母对AFB1的吸附能力差别很大,这与酿酒酵母吸附赭曲霉毒素[9]的情况类似。同时研究发现,经过加热处理后酿酒酵母菌体对AFB1的吸附能力明显增强,这与Shetty[8]等人的研究结果相一致。此外,Shetty等对菌体处理方式等吸附条件进行优化后,酵母菌株A18和26.1.11对PBS中AFB1的吸附率明显升高,分别达到79.3% 和 77.7%,而在我们的实验中,改变Y1的菌体处理方式和吸附时间后,吸附率提高到81.16%(见2.2.1),在后续的研究中,我们将继续对其他吸附条件进行系统的优化,进一步提高其对AFB1的吸附能力。

3.2 Y1与AFB1的作用机理

    关于AFB1与益生菌的结合,有些文献报道是可逆的,有些则报道是不可逆的[10,11],本研究通过复合物稳定性实验,发现甲醇、乙腈等试剂可以溶出酿酒酵母Y1-AFB1复合物中的AFB1,表明Y1与AFB1是通过物理方式结合在一起的,且二者的结合是可逆的。此外,吸附时间对吸附率的影响实验结果表明,Y1对AFB1的吸附是一个快速过程,吸附时间为5min时,Y1即能吸附78.59%的AFB1,随后随着吸附时间的延长,吸附率逐渐升高,当吸附时间为60min时达到吸附饱和点(吸附率为81.16%),之后随着时间增加Y1对AFB1的作用显著减弱,这也说明Y1是通过物理吸附去除了AFB1,达到吸附饱和点之后,Y1还可能释放出少量已吸附的AFB1

目前,科学家们已经对益生菌吸附AFB1的位点进行了一系列的推测和研究,但是还没有得出确切的结论。Haskard等人[12]通过Elisa实验发现是鼠李糖乳杆菌细胞表面的某种成分吸附了AFB1,Raju[13]及Stanley等[14]将酵母细胞壁提取物分别加入到混有AFB1的肉鸡和小鼠日粮中,均有效降低了AFB1对肉鸡和小鼠的毒害作用,说明吸附AFB1的是酿酒酵母细胞壁上的某种成分。本研究通过电镜观察发现,经100℃加热30min处理后,Y1细胞壁由光滑变得凹凸不平,并且明显增厚,因此推断,Y1吸附AFB1的位点也是在其细胞壁上,但参与吸附的具体成分目前尚不清楚。加热处理后Y1细胞壁由光滑变得凹凸不平可能是由以下两种变化引起的:一是加热使细胞壁的结构由致密变得疏松;二是加热使细胞表面的一些物质发生了溶解,这两种变化都能增加细胞壁的通透性,导致细胞表面一些隐藏的吸附位点暴露,同时增加其与AFB1的接触面积,从而提高Y1对AFB1的吸附能力。加热处理后Y1细胞壁增厚可能是由细胞壁上的蛋白质变性引起的,Y1细胞壁增厚也可以增加其与AFB1的接触面积,提高Y1对AFB1的吸附能力。因此,经100℃加热处理后,Y1对AFB1的吸附能力显著增强,而经121℃高压灭菌后,吸附能力更强。

 

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基金项目:人事部留学人员科技活动择优资助项目(优秀类);中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(0032007003);“948”项目:食品安全风险评估技术

[1]作者简介:刘畅(1984-),女,在读硕士,研究方向为农产品质量与食物安全。E-mail:liuchangxyz@163.com 15810140271,010-62815874。

*通信作者:刘阳(1965-),男,研究员,博士,研究方向为食品质量与安全和食品生物技术。E-mail:liuyangg@hotmail.com

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