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控制pH同步流加蔗糖高效培养乳酸菌USTB-08和生产乳酸研究
[浏览次数:1112 次] [更新时间:2017-11-15]

控制pH同步流加蔗糖高效培养乳酸菌USTB-08和生产乳酸研究

 

吕 乐 王子敬 张可毅 包有霞 乔 宁 闫 海*

北京科技大学应用科学学院生物科学与技术系,北京 100083

 

摘 要 在批量和补料发酵培养过程中,研究了碳源、氮源、碳氮比、温度和pH等对乳酸菌USTB-08生长和产乳酸的优化控制条件。结果表明采用蔗糖和酵母膏作为唯一碳源和氮源(C/N为5:1)、温度35℃、接种量1%是批量培养乳酸菌的优化培养控制条件。进一步在50 升全自控发酵罐中,采用15%碳酸钠和25%蔗糖作为控制pH和碳源补料的流加液,与其它pH相比,在恒定控制pH 7.0下培养4天内不仅获得了最大的乳酸菌生物量(OD680nm10.2),而且获得了最高的乳酸含量(35.0 g/L)。本研究首次采用控制pH与流加蔗糖同步进行的培养方式,对高效培养乳酸菌和生产乳酸具有非常重要的研究意义和应用价值。

 

关键词 乳酸菌USTB-08;乳酸;高密度培养;pH

Culture of Lactobacillus sp. USTB-08 and production of lactic acid by controlling pH and feeding sucrose simultaneously

LV Le, WANG Zi-jing, ZHANG Ke-yi, BAO You-xia, Qiao Ning, YAN Hai*

Department of Biological Science and Technology, School of Applied Science, University of Science and Technology Beijing, Beijing 100083, China

ABSTRACT The optimal control conditions including carbon source, nitrogen source, ratio between carbon and nitrogen source, temperature and pH for the culture of Lactobacillus sp. USTB-08 and the production of lactic acid in the batch and fed-batch culture were investigated in this paper. It showed that sucrose as sole carbon source, yeast extract as sole nitrogen source, ratio of 5:1 between carbon and nitrogen source, 35 ℃ and  inoculum amount of 1% were the optimal parameters for the growth of Lactobacillus sp. in batch culture.. Further the experiments of fed-batch culture by feeding the mixture of 15 % sodium carbonate and 25 % sucrose for the control of pH in a 50 L fermentor indicated that both the maximum biomass of Lactobacillus sp. USTB-08 (OD680nm10.2) and the maximum content of actic acid (35.0 g/L) were obtained at pH of 7.0 among pH range from 5 to 7.0 at day 4. The strategy of controlling pH and feeding sucrose simultaneously was firstly used in the fed-batch culture of Lactobacillus sp, which is very important in the culture of Lactobacillus sp.and production of lactic acid .

KEY WORDS Lactobacillus sp. USTB-08; lactic acid; high density culture;; pH

 

作为有效微生物菌群[1] (Effective Microorganisms) 的主要菌种组成之一,乳酸菌是一类能够利用糖类发酵产生乳酸细菌的总称[2]。乳酸菌是革兰氏阳性菌,具有高度的耐酸性,不形成芽孢,基本不能运动,具有促进营养成分的分解和吸收、降低胆固醇、抑制病原菌增殖、增强免疫、改善食品风味和延长储存时间等多种功能[3-10]。乳酸菌培养过程中除了需要碳源、氮源和无机盐外,还要加入维生素、多种氨基酸和肽等[11]。在批量培养过程中,由于乳酸菌能够把糖类发酵产生乳酸导致培养体系pH急剧下降,因此严重抑制了乳酸菌的生长和产生乳酸的量。Solange I. Mussatto[12]等和李丹[13]等发现培养过程中由于乳酸的积累和pH的下降,菌体生长受到抑制。虽然在发酵罐乳酸菌厌氧培养过程中通过流加碱进行pH的恒定控制,可以缓解pH过低对乳酸菌生长和产乳酸带来的不利影响,但初始底物糖类浓度过高也会在一定程度上抑制乳酸菌的生长。Sachin R. Kadam[14]等和靳志强[15]等发现菌体浓度随初糖浓度的增大而增加,但过高的底物浓度反而抑制了细胞的快速增殖。因此如何既能够保持培养体系pH的恒定,同时又能够维持一定的糖类浓度是培养乳酸菌厌氧发酵培养成败的关键。

本文在成功筛选出一株乳酸菌的基础上,重点围绕乳酸菌的批量和流加培养控制条件的优化进行了研究。首次采用15 %碳酸钠和25 %蔗糖作为控制pH和糖类的流加液,在成功恒定控制pH的同时流加蔗糖以支持乳酸菌的快速生长和高产乳酸,不仅获得了最大的乳酸菌生物量(OD680nm10.2),而且获得了较高的乳酸含量(35.0 g/L)。本研究对高效培养乳酸菌和发酵生产乳酸具有非常重要的应用前景。

 

1 材料与方法

1.1 菌种

本实验所用的乳酸菌从北京市延庆县妫水湖岸边泥土中分离纯化得到,依据《常见细菌系统鉴定手册》[16]和《伯杰细菌鉴定手册》[17]鉴定为乳酸菌,命名为乳酸菌USTB-08

1.2 培养基

根据文献报道[18]配制批量培养基,其中碳源选择蔗糖、葡萄糖、甘油和糖蜜;氮源选择酵母膏、蛋白胨、尿素和硝酸钾。通过不同碳氮源批量培养的优化组合实验,确定流加培养的碳源和氮源组成。

1.3 研究方法

(1)批量培养碳源和氮源的选择与优化: 选择蔗糖、葡萄糖、甘油和糖蜜4种含碳有机物分别作为碳源,采用酵母膏、蛋白胨、尿素和硝酸钾4种含氮化合物分别作为氮源。通过不同条件组合的实验,研究确定批量培养乳酸菌的优化碳源、氮源和碳氮比。碳源按照总有机碳都为4 g/L的量分别加入,氮源按照总氮0.4 g/L的初始浓度分别加入。培养基和所用器皿均经过121 ℃ 20 min的高温高压灭菌后使用。

(2)批量培养控制条件: 在100 ml三角瓶中进行密闭厌氧培养,研究了不同培养温度和接种量对乳酸菌生长的效应。实验开始后,每天取样在722S型分光光度计上测定光密度(OD680nm)以示乳酸菌的生长。

(3)控制pH同步流加碳源的培养:依据批量培养优化的条件,在50升全自控发酵罐中进行恒定控制pH同步流加碳源的培养方式,培养量30升,控制pH的流加液组成为25 %蔗糖和15 %碳酸钠的混合溶液,pH控制范围在5.0-7.0。实验开始后每天取样2次分别测定OD680nm和乳酸含量[19-20]

 

2 实验结果

2.1 不同碳源对乳酸菌生长的影响

图1显示,与葡萄糖、甘油和糖蜜相比,蔗糖是支持乳酸菌快速生长的最优碳源,培养4 d后,其OD680nm可达1.5。虽然糖蜜中含有蔗糖成分,但能够支持乳酸菌生长的碳源不足,培养4 d OD680nm仅为0.7左右。葡萄糖虽然也可以作为支持乳酸菌生长的碳源,但较蔗糖和糖蜜差,而甘油基本不能作为支持乳酸菌生长的碳源。

图1 碳源对乳酸菌生长的影响

Fig. 1 Effects of carbon plain on growth of Lactobacillus sp.

2.2 不同氮源对乳酸菌生长的影响

图2显示,与硝酸钾、尿素和蛋白胨相比,酵母膏是支持乳酸菌快速生长的最优氮源,培养4 d后,其OD680nm可达1.7。蛋白胨虽然也可以作为有机氮源支持乳酸菌的生长,但培养4 d OD680nm仅为0.4左右,硝酸钾和尿素不能作为氮源支持乳酸菌的生长。

图2 氮源对乳酸菌生长的影响

Fig. 2 Effects of nitrogen plain on growth of Lactobacillus sp.

2.3 不同碳氮比对乳酸菌生长的影响

采用蔗糖和酵母膏作为乳酸菌生长的碳源和氮源,在固定碳源用量为10.0 g/L下,通过改变碳氮比研究了对乳酸菌生长的影响。图3显示,C/N为5:1时,乳酸菌生长速度最快,培养第4 d OD680nm为1.3。随着碳氮比的增大,乳酸菌生长延迟期增加,当C/N增加到20:1时,乳酸菌在前4 d基本不生长,从第5 d才开始生长。当C/N更进一步增加到40:1时,乳酸菌在5 d内基本不生长。此结果说明采用蔗糖和酵母膏作为乳酸菌生长的碳源和氮源,在C/N为5:1时是培养乳酸菌的优化培养控制条件。

图3 碳氮比对乳酸菌生长的影响

Fig. 3 Effects of carbon to nitrogen ratio on growth of Lactobacillus sp.

2.4 培养温度和接种量对乳酸菌生长的效应

图4是乳酸菌培养5 d的结果,在25到40 ℃范围内,35 ℃是培养乳酸菌的最佳温度。图5表明,接种量为1 %时,培养5 d后的乳酸菌生物量最大,培养结束时其OD680nm为1.3。说明接种量过低延长乳酸菌的生长延迟期,接种量过高则带入较多的生长代谢物从而影响乳酸菌的生长。

图4 培养温度对乳酸菌生长的影响

Fig. 4 Effects of temperature on growth of Lactobacillus sp.

图5 接种量对乳酸菌生长的影响

Fig. 5 Effects of inoculum amount on growth of Lactobacillus sp.

2.5恒定控制pH同步流加蔗糖对乳酸菌生长和产乳酸的效应

图6是在50升全自控发酵罐中,基于恒定控制pH同步流加蔗糖作为碳源的补料方式对乳酸菌生长和产乳酸的效果。在恒定控制pH为5.0、6.0和7.0下乳酸菌均经历了生长延迟期(0-12 h),指数期(12-36 h)和稳定期(36 h以后)的3个不同生长阶段。与pH 5.0和6.0相比,在pH 7.0下乳酸菌的生长非常迅速,48 h OD680nm达到了10左右,远远超过了同期 pH 5.0和6.0下OD680nm为2.6和3.9的水平,分别使乳酸菌生物量提高了277 %和151 %(图6 a)。与乳酸菌生长相对应,48 h时,pH 7.0下蔗糖流加量和乳酸产量分别为70.8 g/L和27.9 g/L,明显高于同期 pH 5.0和6.0下蔗糖流加量和乳酸产量分别为28.3 g/L、2.9 g/L和45.8 g/L、15.0 g/L的水平(图6 b、c)。在pH 7下,糖转化乳酸率为37.5 %,明显高于pH 5.0和6.0下糖转化乳酸率分别为10.2%和32.8%的水平。

图6基于恒定控制pH的补料流加培养方式对乳酸菌生长和产乳酸的效应(a乳酸菌生长;b蔗糖流加量; c 产乳酸量)

Fig. 6 Effects of growth and lactic acid production on fed-batch fermentation based on control pH (a: growth of Lactobacillus sp.; b: feeding amount of sucrose; c:lactic acid content)

 

3 讨论与分析

乳酸菌营养要求复杂,正常生长除了需要碳源、氮源、无机盐外,还需要氨基酸和维生素等生长因子。一般乳酸菌可以利用葡萄糖等多种单糖及一些简单寡糖作为碳源,并能利用多种氮源。谷长维[21]等和熊晓辉[22]等研究研究发现:麦芽糖:乳糖(1:1)、牛肉膏是乳酸菌生长的最优碳源和氮源。熊涛[23]等研究发现乳酸菌NUC0101在5 %葡萄糖和1 %蛋白胨下生长的菌体浓度最高。我们研究发现乳酸菌USTB-08适宜生长的碳源为蔗糖(图1),氮源为酵母膏(图2)。与蔗糖相比,葡萄糖属于单糖最容易被乳酸菌利用,但在其代谢过程中产酸速度较快,从而导致培养基pH的快速降低,因此不适于乳酸菌的高密度培养。糖蜜中虽然含有蔗糖成分,但由于乳酸菌不能利用糖蜜中的多糖,因此也不适于乳酸菌的高密度培养。与蛋白胨和无机氮源相比,酵母膏中含有丰富的氨基酸类化合物、B族维生素和生长因子,而乳酸菌本身合成氨基酸和维生素,尤其是B族维生素的能力差,因此酵母膏是支持乳酸菌USTB-08生长的最优氮源。乳酸菌培养属于生长耦联型,在培养过程中菌体的生长和乳酸的生成是同步进行的,由于乳酸菌把大量糖类转化为乳酸,而非转化为菌体成分,因此菌体对氮源的需求量相对较大,因此当C/N为5:1时乳酸菌生长速度最快(图3)。

温度是控制微生物代谢的重要参数,其主要作用是影响各种酶促反应的速率。每种微生物都有不同的最适生长温度,同种微生物在不同的培养基中生长的最适温度也有差别。乳酸菌的最适生长温度一般随着菌种、培养基成分、培养条件和菌体生长阶段变化而改变,不同的乳酸菌最适生长温度范围会有一定的差异。M.S.A. Tango[24]等研究发现42 ℃是乳酸菌(Lactobacillus helveticus)生长和产乳酸的最适温度。Ani Idris[25]等发现乳酸菌(Lactobacillus delbrueckii)的最适生长温度为37 ℃。熊涛[23]等发现:乳酸菌NUC0101的最适生长温度为30 ℃。我们筛选的乳酸菌USTB-08最适生长温度为35 ℃(图4),温度过高和过低都会影响乳酸菌的生长。接种量的高低直接影响乳酸菌的生长繁殖和乳酸的积累,通常接种量较低,菌体生长缓慢且不利于乳酸的积累,接种量较高则带入较多的生长代谢物从而影响乳酸菌的生长。谷长维[21]等和熊晓辉[22]等研究发现乳酸菌活菌数以接种量5 %时最高,我们研究发现乳酸菌USTB-08在接种量为1 %时培养获得的菌体浓度最高(图5)。

乳酸菌发酵属于生长耦联型发酵,发酵过程中产生乳酸,大量的乳酸积累一方面使发酵液的pH降低,当pH降到4.0以下时,就会对乳酸菌的生长产生严重的抑制作用,另一方面乳酸的积累还会发生产物抑制作用,影响乳酸菌生长。因此,在乳酸菌发酵过程中,必须通过流加营养物质、调节pH值和排除代谢产物等方法以获得高密度培养。Wanmeng Mu[26]等研究发现在补料分批发酵过程中通过流加NaOH恒定控制pH 6.0,12 h后每隔2 h流加100 g/L的苯丙酮酸120 ml 和500 g/L的葡萄糖50 ml,使乳酸菌(Lactobacillus sp. SK007)生长和3-苯基乳酸产量得到了明显提高。Shaofeng Ding[27]等研究发现以氨水控制发酵pH 6.25,以指数流加的补料方式流加850 g/L葡萄糖和1 %酵母膏,乳酸菌(Lactobacillus casei LA-04-1)的细胞干重可达4.3 g/L,乳酸产量可达180 g/L。上述2种流加方式均将pH控制和糖的流加分开进行,而本研究首次将控制pH与同步流加碳源相结合,在成功控制发酵液pH恒定的同时同步流加蔗糖作为碳源,达到了使乳酸菌USTB-08既能够快速生长,又能够高产乳酸的目的(图6),无论是在进一步基础研究还是在产业化生产方面均具有重要的意义。

 

4 结论

(1)从北京市延庆县妫水湖岸边泥土中分离纯化出一株乳酸菌USTB-08,发现蔗糖和酵母膏是支持其快速生长的优化碳源和氮源。在C/N为5:1、培养温度35℃和接种量1 %是乳酸菌USTB-08的优化培养控制条件。

(2)在50升全自控发酵罐中,首次采用15 %碳酸钠和25 %蔗糖作为控制pH的流加液,在成功恒定控制pH的同时流加蔗糖以支持乳酸菌的快速生长和高产乳酸。在pH5 到7 范围内,pH 7.0条件下培养4天,不仅获得了大量的乳酸菌生物量(OD680nm10.2),而且获得了大量的乳酸(35.0 g/L),为进一步基础研究和应用奠定了重要的基础。

 

参 考 文 献

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基金项目:国家自然科学基金(20777008)、北京市教委共建项目和北京市校企共建基金联合资助项目

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