暂无数据!
第二个广告位
  当前位置:学术论文
日本利用糖基转移酶和α-淀粉酶生产海藻糖机理介绍
[浏览次数:2587 次] [更新时间:2017-11-2]

李兴军

(国家粮食局科学研究院  北京  100037)

 

摘要 介绍了日本学者采用蛋白纯化技术从硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus KM1)纯化糖基海藻糖生产酶(糖基转移酶)和糖基海藻糖-水解酶(α-淀粉酶),并定性及阐明酶催化机制。同时从节杆菌(Arthrobacter)和硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)分离到麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖海藻糖水解酶(MTHase)。这对我国功能性糖、糖酶研究开发有参考意义。

关键词:海藻糖,硫化叶菌,节杆菌,糖基转移酶,糖基海藻糖水解酶

 

An Introduction of Trehalose Production with Enzymatic System from Sulfolobus sp and Arthrobacter sp in Japan

LI Xing-jun

(Academy of the State Administration of Grains, Beijing 100037)

Abstract: In 1990s the enzymatic systems for trehalose production, glycosyltreholose-producing enzyme and glycosyltreholose-hydrolyzing enzyme, were purified from Sulfolobus solfataricus KM1. At the same time the other two enzymes, maltooligosyl trehalose synthase and maltooligosyl trehalose trehalohydrolase, were purified from Arthrobacter sp. Q36 and Sulfolobus acidocaldarius.

Key words: Tehalose, Sulfolobus solfataricus/Sulfolobus acidocaldarius, Arthrobacter sp, glycosyltreholose-producing enzyme, glycosyltreholose-hydrolyzing enzyme

 

海藻糖可用于食品、化妆品及药物等行业,在于其特性:①甜度低:海藻糖的甜度低于蔗糖的一半,质量优良。为了降低糖食、风味品及罐制品的甜度,海藻糖可以代替蔗糖。②热和酸稳定性好:由于它无还原力、热稳定性较高或pH稳定性较宽,海藻糖在氨基酸和蛋白质食品中不能降解氨基化合物。这些成分在食品加工和保存期间可以防止营养败坏。③阻止恶化:海藻糖阻止淀粉的

表1 食品中海藻糖的功能

特性

举例

甜度低

粘性稻蛋糕、豆酱、硬糖果、奶油胨、奶油、口香糖、巧克力、冰淇淋

增加热稳定性

豆酱、茶饮料、果饮料

阻止淀粉倒退

粘性稻饼、面条

阻止冷冻期间蛋白变性

鱼肉面团产品、鸡蛋加工品、生面团

阻止吸湿

稻饼、快餐饼、烤饼、小块糖果、粉状糖

阻止油滴形成

鞭打奶油、鸡蛋加工品

阻止变黄

绵蛋糕、小饼、火腿

提高风味品质

米饭、冰淇淋、酱油

改善质地

面条、咸菜

保鲜作用

生蔬菜、水果

倒退、蛋白质变性和脂肪的氧化。这些性质有利于储存淀粉性食品(面包、面条及蛋糕)、含有鸡蛋和鱼肉的富蛋白质食品及含有肉、油炸食品(表1)。④其它特性是,海藻糖在食品中阻止吸湿,防止食品如稻饼、快餐蛋糕、小块蛋糕由于吸湿而被破坏。它还可以掩盖食品的苦味和肉的臭味。口腔微生物对海藻糖的酸化产物与对蔗糖的酸化产物比较低,海藻糖用于甜化剂,几乎不诱导牙病。海藻糖及硫酸盐在化妆品面霜、洗液作为湿度保持剂。它的脂肪酸酯作为化妆品表面活性剂。它也用于医药和诊断剂的稳定剂。本文对日本学者利用糖基转移酶和α-淀粉酶催化海藻糖生产机理作一介绍,以期对我国功能性糖及糖酶研究开发有参考意义。

1 海藻糖生产方法回顾

海藻糖(O-α-D-glucopyranosyl-(1,1)-α-D-glucopyranoside,α,α-海藻糖)是一个非还原二糖,两个葡萄糖残基以α-1,1连接结合。海藻糖广泛地分布在微生物、植物及昆虫中。它的生物学功能是,作为贮藏物质,从热和渗透变化中保护蛋白质和细胞膜,也是昆虫运动能量的来源。从古代,人类从蘑菇、海藻、龙虾、面包酵母、酿酒酵母等获得海藻糖。这个二糖像蔗糖一样有好的甜度,在食品工业用于甜味佐料。由于它是食品、化妆品及药品的保护剂,人们努力寻找海藻糖生产方法,但是没有发现最满意的方法以降低生产成本。20世纪90年代初期,海藻糖生产主要从酵母细胞提取,在酵母含量仅20%,纯化花费大,成本高达2000元/公斤。因此它以小批量用于试剂和化妆品,在食品原料不能大量利用。海藻糖酶法合成的机理如图1。

图1 海藻糖酶法合成的三种类型

 

除过从酵母细胞提取外,利用细菌短杆菌(Brevibacterium)和棒状杆菌(Corynebacterium)发酵,由连续2个磷酸化酶(麦芽糖磷酸化酶和海藻糖磷酸化酶)反应合成[1-2]。这些方法降低海藻糖价格到210元/公斤,但是不能用于工业生产。

采用酶的转糖基化作用从淀粉、麦芽寡聚糖直接生产海藻糖,被认为是一种切实可行的方法。Lama等[3-4]报道喜热喜酸性古细菌硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)的细胞匀浆物,有耐热的淀粉水解酶活性,将淀粉水解产生葡萄糖和海藻糖。他们指出,分子内转移反应参与形成海藻糖,但没有说明什么酶参与这个反应,也没有对该酶进行成功纯化。利用催化这个反应的酶在工业上生产海藻糖有几个优点:此酶来自喜热的古细菌,在高温下加快了反应,减少了淀粉倒退的逆反应,减少了微生物对反应混合物的污染。而且,该酶利用不昂贵的淀粉大大地减少了生产成本。为了定性该酶活,并确定它们如何作用淀粉产生海藻糖,Kato等[5-7]从硫化叶菌KM1菌种纯化了该酶,阐明了糖基转移酶和α-淀粉酶的催化途径。另外,Nakada等从原核生物节杆菌(Arthrobacter sp[8-9]和嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius[10-11]研究相似的酶。

2硫化叶菌海藻糖生产酶

2.1 糖基海藻糖生产酶(糖基转移酶)

(1) 改进糖基海藻糖酶纯化法

硫化叶菌KM1在1993年从日本群马县县酸性温泉中分离[12]。KM1在有氧75℃条件下pH 4.0标准培养基上培养。 KM1的细胞匀浆物以10%的淀粉作为底物,在60℃水解淀粉,产生海藻糖。以淀粉作为底物,用Phenyl-toyopearl柱层析先分离这个单峰酶活性。用DEAE-toyopearl柱进一步纯化,产生一个单峰仅有淀粉水解酶活,没有海藻糖生成活性。于是,以短链的麦芽寡聚糖(麦芽三糖)作为底物,对DEAE-toyopearl柱层析成分检测海藻糖生成活性。结果发现,一种未知的三糖被检测为反应产物,用葡萄淀粉酶水解这个三糖产生葡萄糖和海藻糖。深入分析表明,在底物上,该酶偏爱麦芽五糖,而不是麦芽三糖。以麦芽五糖作为底物纯化了该酶活性。一个单位糖基转移酶定义为,在60℃下每分钟生成1 μmole的海藻糖。

(2) 检测反应产物的结构

1H和13C NMR光谱技术分析反应产物表明[6],酶催化麦芽寡聚糖转化为相应的糖基海藻糖,每个糖基海藻糖带一个海藻糖分子结构作为末端单元(糖基海藻糖是大于DP3的寡聚糖)。副产物分析表明,比底物聚合度高的糖基海藻糖在酶反应中不能检测到。这个反应明显是分子间转糖基化作用。

(3) 底物特异性

利用纯化的糖基转移酶,以各种链长的100 mM麦芽寡聚糖为底物。麦芽五糖是最适底物,比麦芽三糖反应率高20倍。麦芽海藻糖、麦芽三糖基海藻糖、麦芽四糖基海藻糖及麦芽五糖基海藻糖,聚合度都多于4个,产量超过78%,但DP3的糖基海藻糖产量仅45为%。糖基海藻糖生成中,伴随的副产物有葡萄糖,以及副水解反应生成缩短一个葡萄糖的麦芽寡聚糖。酶反应的特点是,生成的水解物产量低、 Km值低(高亲和力)、高Ko值,生成的链长较长底物糖基海藻糖是高产量。

2.2 糖基海藻糖-水解酶(α-淀粉酶)

(1) α-淀粉酶纯化方法的建立

从DEAE柱层析分离的淀粉水解酶活性组分,加上纯化的糖基转移酶活性,从淀粉就直接产生海藻糖。这表明淀粉水解酶活性水解糖基海藻糖成为海藻糖。在麦芽三糖基海藻糖水解产物中,仅检测到海藻糖和麦芽三糖。根据这些结果,以麦芽三糖基海藻糖作为底物,用淀粉酶分析纯化了酶。该淀粉酶的定义一个单位(U)为,60℃条件每分钟从麦芽三糖基海藻糖水解1 μmol海藻糖的酶量。

(2) 反应产物和底物特异性的确定

纯化的α-淀粉酶底物的特异性,以10 mM的糖基海藻糖和各种链长的麦芽寡聚糖为底物,释放的单寡聚糖或寡聚糖用HPLC测定[7]。从糖基海藻糖产生的海藻糖量,或从麦芽寡聚糖产生的葡萄糖和麦芽糖的总量计算相对反应速率,并与麦芽四糖基海藻糖的反应速率(定义为100%)比较。

超过DP3的糖基海藻糖和超过DP2的麦芽寡聚糖用于酶底物分析。对糖基海藻糖的水解速率比对麦芽寡聚糖的快6-15倍。多于5个葡萄糖残基的糖基海藻糖更适合,而海藻糖、异构麦芽糖、异构麦芽三糖、异构麦芽四糖、异构麦芽五糖、潘糖都不是合适的底物。就速率参数,对糖基海藻糖的米氏常数Km随着链长的增加而减少,对麦芽海藻糖和麦芽五糖基海藻糖的Km分别为22.4 mM和4.7 mM。分子活性常数Ko对麦芽海藻糖和麦芽四糖基海藻糖从339增加到866 sec-1

2.3 海藻糖生产酶的物理化学特性及基因分析

海藻糖生产酶的物理化学特性是,它们喜热稳定,最大活性条件在pH 5-6和70-80 ℃(表2)。在85 ℃接种6小时后酶至少保持91%的活性。在Sulfolobaceae家族其它品种检索这些酶,同样作用方式的酶被鉴定和纯化。该酶广泛地分布在Sulfolobaceae家族,不限于种类Sulfobus

表2 糖基转移酶和α-淀粉酶的物理化学特性[12]

 

糖基转移酶

α-淀粉酶

最佳pH

5.0~6.0

4.5~5.5

pH稳定性

4.0~10.0

3.5~10.0

反应最佳温度(℃)

70~80

70~85

热稳定性(85℃ 6小时)

91%

100%

分子量(SDS-PAGE)

76 KDa

61 KDa

糖基转移酶和α-淀粉酶基因的核酸序列表明[13],它们各是氨基酸数目728个和558个的蛋白,分子量各是86 KDa和65 KDa。这些值一致于SDS-PAGE分离的酶蛋白。尽管α-淀粉酶的起始密码子是ATG,但该蛋白的氨基酸序列分析表明,N端氨基酸是亮氨酸。尽管这些海藻糖产生酶的全部氨基酸序列,不同于α—淀粉酶家族包含的其它酶,但α—淀粉酶家族的高度保守序列存在于它们的氨基酸序列中。因此,这些海藻糖产生酶可能属于α-淀粉酶家族,有相似的(α/β)8的Tim桶催化结构域。

2.4 海藻糖生产酶的催化机制

2.4.1 糖基海藻糖生产酶(糖基转移酶)

(1) 用3H-标记底物分析转糖基化机制

 

 

 

 

 

I.非还原端[3H]标记的麦芽五糖反应液中加入硫化叶菌KM1的糖基转移酶,然而葡萄糖淀粉酶处理。水解产物采用TLC平板色谱层析,然后测定葡萄糖和海藻糖成分的放射性。II.圆圈对应葡萄糖残基,圆圈的影阴部分表示C1-OH位置,无影阴部分表示C4-OH位置. 信号表示[3H]标记的葡萄糖残基。

图2 糖基转移酶和葡萄糖淀粉酶依次对[3H]标记的麦芽五糖的水解[6]

用糖原合成酶准备的10 mM非还原端[3H]标记的麦芽五糖,然后接种于纯化的3 U/ml糖基转移酶,在pH 5.5和60℃条件反应 3小时。 反应产物在40℃用5 U/ml 葡萄糖淀粉酶处理过夜。水解产物用于硅胶(Kieselgel 60)薄层层析板分离,分离溶剂混合物是丁醇/乙醇/水(5:5:3)。茴香醛-硫酸(Anisaldehyde-sulfate)方法检测单聚糖和二糖成分,每个点刮下,用液体闪烁计数器测量放射性。如图2,绝大多数放射活性在单聚糖组分(葡萄糖),二糖组分(海藻糖)呈极少量放射活性,可能由于放射性葡萄糖的底色活性。这表明3H-标记的葡萄糖残基位于麦芽寡聚糖非还原末端,作为糖基海藻糖的葡萄糖单元。从这些结果看出,糖基海藻糖中海藻糖结构中的葡萄糖残基,不可能来自原麦芽寡聚糖的非还原末端,而是来自还原末端。

(2) 用标记底物证实转糖基化作用

如果分子间转糖基化作用发生,这个酶的催化机制基本上认为是转糖基化作用。水解副反应被解释为,水分子和还原端的葡萄糖分子,作为糖基残基受体,会发生竞争。从基因分析看,这个酶包括α-淀粉酶家族高度保守的序列区,该家族含有转糖基化作用酶。糖基海藻糖生产反应被解释为双取代机制,按照以下描述的麦芽三糖作为模式化合物的反应模式进行。首先底物还原端的葡萄糖基连接的C1-O键(不是O-C4键)被劈开,糖基残基(这种情况下就是麦芽糖残基)结合到酶,以形成糖基-酶中间物。劈开的葡萄糖残基,来自还原端葡萄糖,从位于催化裂缝的一个酶催化氨基酸残基获得一个质子。糖基残基通过α-1,1连接在酶的催化裂缝中转移到葡萄糖。相反,当糖基残基被转移到水分子,水解副反应就反应。

为了肯定该假设酶是转糖基化酶,进一步检测[3H]标记的葡萄糖结合到的麦芽三糖产物,观察到[3H]标记的葡萄糖结合到麦芽三糖成分,它随着葡萄糖浓度的增加而增加。麦芽三糖分子间的转糖基化作用最大水平是24%。因此推出,酶催化分子间转糖基化作用。

为了肯定假设,酶在底物的还原端劈开葡萄糖基连接的C1-O键,用快原子轰击负质谱技术(Fast atom bombardment negative mass spectrometry)分析酶在50%18O标记的水中催化麦芽三糖水解产物(麦芽糖和葡萄糖)。快原子轰击负质谱数据显示,麦芽糖仅有一个分子量2单元比未标记的化合物大,这样肯定了水分子结合到麦芽糖。这些结果支持C1-O键劈开的假设、形成糖基(麦芽糖基)-酶中间物假设的催化机制。反应明显地被分子内转化所推进。从这点讲,该酶可能是一个异构酶。但是从数据看,认为这个酶的催化机制基本上是转糖基化作用。从利用这个酶的角度看,综合认为此酶是一个转移酶。此酶可能类似1,4-α-葡聚糖 4-α-糖基转移酶(4-α-葡聚糖基转移酶, EC 2.4.1.25),它转移1,4-α-葡聚糖到受体葡萄糖的C4-OH位置。这个酶被称为1,4-α-葡聚糖 1-α-糖基转移酶,缩写为糖基转移酶。

2.4.2 糖基海藻糖水解酶(α—淀粉酶)

(1) 采用3H标记底物分析水解机制

10 mM非还原末端3H标记的麦芽三糖基海藻糖和麦芽五糖,在50 mM乙酸钠pH5.5 及60℃条件下,分别接种在0.1 U/ml 或1 U/ml 纯化的α-淀粉酶,反应3小时后水解产物用薄层层析分离。单糖和寡聚糖按茴香醛-硫酸方法检测。每个点刮下用液体闪烁计数器测量放射性。如图3I和3III,标记的麦芽五糖从三糖和四糖(麦芽三糖和麦芽四糖)成分中回收。在单糖和二糖(葡萄糖和麦芽糖)成分中未检测到放射性。标记的麦芽三糖基海藻糖的放射性在三糖(麦芽三糖)成分中观察到,在二糖成分(海藻糖)中未检测到。根据这些结果,α-淀粉酶从还原端以1个或2个葡萄糖残基水解麦芽寡聚糖(图3II)。Α-淀粉酶从还原末端水解糖基海藻糖,劈开邻接α-1,1海藻糖基团的α-1,4糖苷键,以释放海藻糖(图3IV)。与麦芽寡聚糖的对应链长底物比较,糖基海藻糖被酶偏爱,如麦芽四糖基海藻糖比麦芽六糖反应率高15.6倍。

(2) 测定内切型淀粉酶活性

碘-淀粉复合物在620 nm的吸收值,在酶反应期间迅速减少,水解淀粉产生的麦芽寡聚糖的量很低,在兰色值一半处仅检测3.7%的麦芽寡聚糖。这个酶被表明,有内切型α-淀粉酶活性。酶水解的产物带有α-异头基构象,在于麦芽三糖基海藻糖和麦芽五糖水解期间观察到下变旋现象。从基因分析看,酶含有α-淀粉酶家族高度保守的序列区。酶的三维晶体结构分析表明,催化氨基酸残基、亚位点结构、(α/β)8的Tim桶催化区域类似于Taka-淀粉酶。从这些结果看出,这个酶是α-淀粉酶。

(3) α-淀粉酶对糖基海藻糖的选择性反应力

此酶有内切型淀粉酶活性和麦芽寡聚糖水解活性,被认为是α-淀粉酶,但底物特异性和酶的水解方式不同于其它来源的α-淀粉酶。而且α-淀粉酶不能从糖基海藻糖释放海藻糖。根据反应产物分析,α-淀粉酶有亚位点结构,活性中心位于在第二个α-1,4糖苷键连接(从还原端计数)。对底物的空间堵塞,接近于底物还原端的那边(图3V和3VI)。由于存在空间堵塞“墙”,内切型淀粉酶对长链底物如淀粉、直链淀粉的水解活性就弱。

 

 

非还原端[3H]标记的麦芽五糖(I)和麦芽三糖基海藻糖(III)反应液中加入硫化叶菌KM1的α-淀粉酶。水解产物采用TLC平板色谱层析,然后测定单糖和寡聚糖成分的放射性。S1-单糖;S2-二糖;S3-三糖;S4-四糖;S5-戊糖。圆圈对应葡萄糖残基,圆圈的影阴部分表示C1-OH位置,无影阴部分表示C4-OH位置. 信号表示[3H]标记的葡萄糖残基。

 

图3  α-淀粉酶对3H标记的麦芽三糖基海藻糖(I、II)和麦芽五糖(III、IV)的水解,以及α-淀粉酶对麦芽三糖基海藻糖(V)和麦芽戊糖(VI)的催化机制图示[7]

 

为了阐明对糖基海藻糖的催化机制和选择性反应力,就要注意麦芽寡聚糖的水解活性,分开测定葡萄糖和麦芽糖的释放速率参数。如表3,该酶对较长链长的糖基海藻糖有较低的Km和较高的Ko。另一方面,该酶对麦芽寡聚糖的Km值指明,就链长看,与糖基海藻糖有相似的趋势,而Ko值较低;尤其对较短链底物,对麦芽糖释放的值比对葡萄糖的释放值低。对麦芽寡聚糖的Km值的相似趋势,被认为是非生成性结合模式的原因。两个底物结构比较分析表明,在亚位点1对糖基海藻糖和麦芽寡聚糖底物的亲和力是影响反应力的重要因素。因此,对麦芽寡聚糖亚位点亲和力的计算,按照亚位点理论的内切型淀粉酶分析法。初步的数据表明,在亚位点1对麦芽寡聚糖的亚位点亲和力的值约是-0.4 Kcal/mol(图3VI)。另一方面,假设糖基海藻糖和麦芽寡聚糖之间的Kint值是一样的,对糖基海藻糖的Bn,P值(分子结合亲和力)高于对麦芽寡聚糖的。【ln(Ko/Km)tre-ln(Ko/Km)mal】/RT(Tre指从糖基海藻糖释放海藻糖, Mal指从麦芽寡聚糖释放麦芽糖;R和T分别是气体常数和绝对温度)的值,对底物链长4、5、6和7约分别是4、3、2和2 Kcal/mol。这样在亚位点1对糖基海藻糖的底物亲和力大大高于麦芽寡聚糖(图3V)。因此糖基海藻糖和麦芽寡聚糖之间的反应力差异性,来自亚位点1对两个底物亲和力的差异性。

对α-1,4葡聚糖(maltononaose、直链淀粉DP17、DP100)较长链的表观(apparent) ko值明显地低于对糖基海藻糖。这表明糖基海藻糖和麦芽寡聚糖之间的Kint可能不一样。糖基海藻糖和麦芽寡聚糖之间的Ko的差异还不清楚。根据糖苷水解酶催化机制的前例,位于这个酶亚位点3的葡萄糖残基,扭曲成为一个半椅构象,接着通过进攻水分子水解就进行。就糖基海藻糖,亚位点3的葡萄糖残基,容易扭曲,或者导致水分子进入催化中心,因此Kint是很高的。就麦芽寡聚糖,相反,由于结构的差异性如亚位点1葡萄糖残基的方向,形成扭曲过程或进攻水分子不容易进行, Kint值就非常低。另一个假设是,糖基海藻糖水解化学过程的催化机制,明显不同于麦芽寡聚糖,还要深入研究。这样,亚位点1亲和性和Ko值的差异性,影响糖基海藻糖和麦芽寡聚糖的相对反应速率。

2.5 酶法海藻糖生产的新途径

图4  从嗜热硫化叶菌(S. solfataricus) KM1酶法生产海藻糖的途径[12]

 

就上述海藻糖生产酶类分析,海藻糖生产的新途径被认为是糖基转移酶和α-淀粉酶一起作用(图4)。糖基转移酶先转化麦芽寡聚糖成为糖基海藻糖,可能通过分子内转糖基化作用进行。α-淀粉酶再水解产生的糖基海藻糖,通过劈开邻近α-1,1糖苷键的α-1,4糖苷键,以释放海藻糖。这可能由于对亚位点1有高度亲和性和对糖基海藻糖高分子活性,而不是对麦芽寡聚糖。在KM1品种的细胞匀浆中也检测到这个分支酶活性。这些酶可以从淀粉产生高产量的海藻糖(约80%)。它们独特的催化机制很有趣,它们使海藻糖生产成本减少100倍,这些酶有重要经济价值。

3 节杆菌和硫化叶菌海藻糖生产酶

Maruta 等1995年从节杆菌(Arthrobacter)属的细菌成功地分离到2个酶[8-9],一个是麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase),是分子内转葡萄糖基酶,催化反应(1);另一个酶是麦芽寡糖基海藻糖海藻糖水解酶(MTHase),催化反应(2)的淀粉酶。

麦芽寡聚糖→麦芽寡糖基海藻糖                                   (1)

麦芽寡糖基海藻糖+H2O→麦芽寡聚糖+海藻糖                       (2)

这个发现表明,连续的MTSase和MTHase反应从麦芽寡聚糖生产海藻糖。在1996年,MTSase和MTHase蛋白从硫化叶菌细胞纯化,硫化叶菌合成的海藻糖是由于MTSase和MTHase反应[10-11]

 

表3节杆菌(Arthrobacter sp)和硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)的MTSase和MTHase特性[11]

 

节杆菌Q36

硫化叶菌 ATCC33909

MTSase

 

 

分子量

81 KDa

74 KDa

等电点

4.1

5.9

最佳pH

7.0

5.0~5.5

最佳温度

40℃

75℃

pH稳定性

6.0~9.5

4.5~9.5

热稳定性

低于40℃

低于85℃

MTHases

 

 

分子量

62 KDa

59 KDa

等电点

4.1

6.1

最佳pH

6.5~7.0

5.5~6.0

最佳温度

45℃

75℃

pH稳定性

5.0~10.0

5.5~9.5

热稳定性

低于45℃

低于85℃

 

与节杆菌属的MTSase和MTHase酶比较 (表3),硫化叶菌酶是喜温的、热稳定的。硫化叶菌酶特性适合从淀粉生产海藻糖。淀粉的高温糖化反应,可以阻止反应进行中淀粉的倒退和微生物污染。硫化叶菌细胞MTSase和MTHase生产力比节杆菌的低,结果地,这些耐热酶的高成本生产在工业付不起。但是,节杆菌细胞生产力好,通过培养条件的合理化、细菌基因的突变等提高酶生产力,允许工业利用节杆菌酶生产海藻糖。MTSase和MTHase在节杆菌细胞内积累,通过自动降解细菌细胞释放到培养基。培养的肉汤经膜过滤,获得浓缩酶液。酶准备物包括MTSase和MTHase,二者的活力比率适合海藻糖生产反应。

海藻糖生产方法如图5。方法基本与麦芽糖生产法一样。淀粉被耐热的α-淀粉酶液化,被淀粉异构酶去支链。形成的直链淀粉与MTSase和MTHase反应就转化为海藻糖(高于80%的产量)。值得注意的是,淀粉异构酶,与MTSase和MTHase一样,是有效形成海藻糖的关键酶。如果不加异构淀粉酶去除支链淀粉,该淀粉不是海藻糖形成的最好底物。由于MTSase/MTHase反应停止在淀粉的支链葡萄糖残基,大部分淀粉不能转化为海藻糖。通过异构淀粉酶去支链反应,淀粉被水解成直链淀粉,直链淀粉是MTSase的一个好底物。有趣的是,节杆菌和硫化叶菌的基因组DNA分析表明,异构淀粉酶、MTSase和MTHase基因构成了一个操纵子。在这些细菌细胞中,这三个酶作为一套海藻糖合成子,从胞内糖原生产海藻糖。

图5 从淀粉工业生产海藻糖[14]

工业生产海藻糖(如图5),除过淀粉异构酶、MTSase和MTHase,其它一些酶被利用。当MTSase/MTHase反应从直链淀粉生产海藻糖,低分子量的糊精葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖产生。CGTase(环化麦芽糊精葡聚糖转移酶)将这些低分子量的糊精转化为MTSase能够反应的大分子。葡萄糖淀粉酶回避MTHase反应,水解一小部分葡萄糖基海藻糖。加入CGTase和葡萄糖淀粉酶这两个酶,以淀粉为底物的海藻糖产量增加百分之几,因此反应产物中海藻糖含量超过85%。脱色和去离子化后,反应产物中海藻糖晶体化。通过普通的晶体化作用,获得二水海藻糖。二水海藻糖含有98%纯海藻糖,商标是“海藻糖”。海藻糖一水晶体通过高温方法可以获得。

参考文献

[1]Murao S, Nagano H, Ogura S, et al. Enzymatic synthesis of trehalose from maltose [J]. Agric Bio Chem, 1985, 49: 2113-2118.

[2] Yoshida M, Nakakuki N, Horikoshi K. Production and application of maltose phosphorylase by a strain of Plesiomonas [J]. Oyo Toshitus Kakaku, 1995, 42: 19-25.

[3] Lama L, Niclaus B, Trincone A, et al. Starch conversion with immobilized thermophilic archaebacterium Sulfolobus solfataricus [J]. Biotechnol Lett, 1990, 12: 431-432.

[4] Lama L, Niclaus B, Trincone A, et al. Thermostable amylolytic activity from Sulfolobus solfataricus [J]. Biotechnol Forum Eur, 1991, 8: 201-203.

[5]Kato M, Miura Y, Kettoku M, et al. Purification and characterization of new trehalose-producing enzymes isolated from the hyperthermophilic archae, Sulfolobus solfataricus KM1 [J]. Biosci Biotech Biochem, 1996, 60: 546-550.

[6]Kato M, Miura Y, Kettoku M, et al. Reaction mechanism of a new glycosylrehalose-producing enzyme isolated from the hyperthermophilic archaeum, Sulfolobus solfataricus KM1 [J]. Biosci Biotech Biochem, 1996, 60: 921-924.

[7]Kato M, Miura Y, Kettoku M, et al. Reaction mechanism of a new glycosylrehalose-hydrolyzing enzyme isolated from the hyperthermophilic archaeum, Sulfolobus solfataricus KM1 [J]. Biosci Biotech Biochem, 1996, 60: 925-928.

[8]Nakada T, Maruta K, Tsusaki K, et al. Purification and properties of a novel enzyme, maltooligosyl treholse synthase from Arthrobacter sp. Q36 [J]. Biosci Biotech Biochem, 1995, 59: 2210-2214.

[9]Nakada T, Maruta K, Mitsuzumi H, et al. Purification and characterization of a novel enzyme, maltooligosyl treholse trehalohydrolase from Arthrobacter sp. Q36 [J]. Biosci Biotech Biochem, 1995, 59: 2215-2218.

[10]Nakada T, Ikegami S, Chaen H, et al. Purification and characterization of thermostable maltooligosyl treholse synthase from the thermoacidophilic archaebacterium Sulfolobus acidocaldarius [J]. Biosci Biotech Biochem, 1996, 60: 263-266.

[11]Nakada T, Ikegami S, Chaen H, et al. Purification and characterization of thermostable maltooligosyl treholse trehalohydrolase from the thermoacidophilic archaebacterium Sulfolobus acidocaldarius [J]. Biosci Biotech Biochem, 1996, 60: 267-270.

[12]Kato M. Trehalose production with a new enzymatic system from Sulfolobus solfataricus KM1 [J]. J Mol Catal. B: Enzymatic, 1999, 6: 223-233.

[13]Kobayashi K, Kato M, Miura Y, et al. Gene cloning and expression of new trehalose-producing enzyme from the hyperthermophilic archaeum, Sulfolobus solfataricus KM1 [J]. Biosci Biotech Biochem, 1996, 60: 1882-1885.

[14]Maruta K, Nakada T, Kubota M, et al. Formation of treholse from maltooligosaccharides by a novel enzymatic system [J]. Biosci Biotech Biochem, 1995, 59: 1829-1834.

 


【首页】  【返回】
电话:010-52706031 传真:010-5206031 地址:北京市海淀区永定路甲4号
版权所有:中国功能性食品网 京ICP备15006164号-1 技术支持:圣辉友联